新品｜Proteintech 染还是不染？ 了解流式細胞儀使用的不同活性染劑
TO DYE OR NOT TO DYE? 染还是不染？
-了解流式細胞儀使用的不同活性染劑
进行流式细胞相关实验分析时，将凋亡细胞排除之於取得可靠、準确的结果至关重要。本文将提供此类用途的全面产物概述，剖析如何针对实验挑选最适合的试剂，让您像007一般，精準挑出干扰分析的凋亡细胞。
在进行流式细胞相关实验分析时，必须排除样品中的凋亡细胞，以取得可靠、準确的实验数据。凋亡细胞可能干扰分析的原因来自：
颈）与抗体的非特异性结合
颈颈）具有比活细胞具有更强的自体萤光
iii）細胞因去氧核糖核酸的釋放而結塊，以上都可能影響數據異動，尤其是在觀察低表達力抗原時，或可能降低細胞分選 (cell sorting) 的效率。
此时可以使用试剂来排除凋亡细胞，目前市面上已有多种试剂可用於标记凋亡细胞，原理则各有不同，伴随着各自的优缺。本篇希望引领读者如何选用标定凋亡细胞的试剂，找出最适合自己的实验目的的产物。
DNA结合染剂 (DNA binding dyes):
在细胞凋亡期间，细胞膜和核膜逐渐分解并变得可渗透，因此，碘化铀（笔滨）、7-础础顿和顿础笔滨这样的染剂可以进入细胞并与顿狈础结合。使用这类染剂的方式相对简单，通常仅需要在正式分析之前将染剂与细胞样本进行的短时间的反应。需要注意的是，样本中的细胞可能持续地凋亡，因此需要确保每个样品於分析之前，在一致的时间内添加染剂，以确保比较的準确性。DNA结合染剂的缺點亦在於它們利用凋亡细胞的膜滲透性，因此它們無法區分經固定過後的活细胞和凋亡细胞。
以下表格整理了目前常见的 DNA 结合染剂：
| PI (Propidium iodide) |
Excitation: 488 nm Emission: 617 nm |
PI可標定核酸，無論是 RNA或是 DNA 都會被標 Protocol example: |
| 7-AAD (7-amino actinomycin D) |
Excitation: 488 nm Emission: 647 nm |
7-AAD染劑可以嵌入G-C rich的雙股DNA結構， Protocol example: |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) |
Excitation: 358 nm Emission: 461 nm |
由紫外光激發，例如，405nm。DAPI與A-T rich Protocol example: |
可固定的细胞染剂 ( Fixable viability dyes ) :
如上所述，DNA结合染剂只能區分未固定樣本中的凋亡细胞。但仍有许多方法可以识别已固定样本中的凋亡细胞。这些称為细胞染剂，原理是與細胞的蛋白質胺基結合，而由於凋亡细胞中的細胞膜受損，染劑可以進入細胞內，與更多的蛋白質結合（圖1），因此凋亡细胞的螢光的強度增高，大約高於活细胞50倍，區分出凋亡與活细胞。细胞染剂，也因此恰如其份地被命名為殭屍染劑™Zombie Dyes™（Biolegend），Ghost Dyes™ 幽靈染劑™（Tonbo Biosciences）等有趣的名稱，另也因易用性、應用性、色彩多變化、搭配彈性，而受到市場的歡迎。
Proteintech近期也推出了一系列细胞染剂：，具有7種螢光波長組合可供選擇（見下文）。幻影染剂與細胞蛋白共價結合，因此樣本在以甲醛和酒精固定後依然保持結合。當然幻影染剂也可用於未固定的活细胞，與不同螢光完美搭配組合，也可作為胺基結合反應材料的控制對照組。相關的詳細使用流程，請參閱PMID 20578108。
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(圖1) Schematic of the mechanism of DNA binding dyes and Phantom Dyes (fixable viability dyes), demonstrating how they differentiate live and dead cells.
Proteintech has the following viability dyes: Phantom Dyes:
Phantom Dye Red 710 Viability Dye
Phantom Dye Red 780 Viability Dye
Phantom Dye UV 450 Viability Dye
Phantom Dye Violet 450 Viability Dye
Phantom Dye Violet 510 Viability Dye
Phantom Dye Violet 540 Viability Dye
Phantom Dye Blue 516 Viability Dye
细胞健康检测 (Cell health assays ) :
细胞健康检测試劑可作為细胞染剂的替代方案，這類產品是利用細胞活性染劑和DNA结合染剂的組合來确定样本中活细胞和凋亡细胞的比例，通常用於萤光活细胞成像以及流式细胞分析。
Calcein AM就是一種常見的細胞活性染劑，屬於非螢光的細胞滲透染劑，與DNA结合染剂不同，這種分子可以進入活细胞。一旦進入細胞，它通過細胞內酯酶 (esterases) 進行乙氧甲基酯 (acetoxymethyl ester) 水解，進而產生绿色萤光（别虫肠颈迟补迟颈辞苍/别尘颈蝉蝉颈辞苍：495/520苍尘）。相反地，凋亡细胞的酯酶活性较低，因此没有萤光。而與不同光譜的DNA 结合染剂一同使用，如：PI（excitation/emission：488/617 nm）或 EthD-I（excitation/emission：528/617 nm）可以測量凋亡细胞與活细胞的比例，能夠在一次檢測中評估可行性和毒性（圖 2）。需要注意的是，這些檢測無法用於經過固定的細胞樣本，因為染劑在無法與固定後的細胞的任何分子結合，因此在染色應儘快進行分析。
Proteintech has a Viability/Cytotoxicity Assay Kit for Animal Live & Dead Cells (Calcein AM, PI Method, Cat# ) and (Calcein AM, EthD-I Method, Cat# ).
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(圖2) Results for the Viability/Cytotoxicity Assay Kit for Live & Dead Cells (Calcein AM, PI) Cat. number . Left: In flow cytometry, live cells have positive signal for Calcein AM (FITC/green detection), and dead cells can be visualized as positive for PI (PE-A/red detection). Right: Fluorescence microscopy of Jurkat cells stained with Calcein AM staining shows live cells in green, and PI staining shows dead cells in red.
用流式细胞技术检测细胞凋亡 ( Detecting apoptosis with Flow Cytometry ) :
细胞凋亡是一个高度调节的细胞机制与过程，对发育和维持生理衡定至关重要。监管不力可导致癌症和阿兹海默症等重大疾病。更多资讯与相关产物可在我们官方部落格上的细胞凋亡专区找到。
流式細胞分析則是研究細胞凋亡的利器之一，因此已有許多相對應的試劑套組和方法學，其中最受歡迎的是Annexin V 和 TUNEL標記法。
Annexin V會與細胞凋亡的早期標誌物：細胞外磷脂蛋白（PS）結合。活细胞的細胞膜的內側會含有PS，然而，在細胞凋亡的早期階段，PS被翻轉到細胞膜的外側；隨著PS暴露在細胞外空間，Annexin V即可結合到PS，若是Annexin V帶有螢光，則早期凋亡的細胞就會被螢光標定，因而區分活细胞和凋亡细胞。 Proteintech的 CoraLite®488-Annexin V和PI凋亡檢測套件（）即是利用螢光結合Annexin V與PI（圖3）同步分析早期、晚期的凋亡细胞
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(圖3) Schematic showing how Proteintech’s CoraLite®488-Annexin V and PI apoptosis detection kit labels early and late apoptotic cells. Catalogue number .
另一種受歡迎的細胞凋亡的檢測法是TUNEL標定。細胞凋亡的另一個主要現象是細胞染色體DNA斷裂、片斷化。這個現象具有法則且規律性，DNA片段是以180-200個鹼基對的倍數的不同長度，利用電泳檢測可見條帶呈現階梯狀。TUNEL標定法及利用終端去氧核糖核酸轉移酶 （TdT） 來催化螢光標記的 dUTP 進入片斷化 DNA 的 3'-OH 端，因此可用螢光顯微鏡直接觀察這些被標記的dUTP-DNA，或通過流式細胞分析進行量化。Proteintech的CoraLite®488和CoraLite®594 TUNEL凋亡檢測套件（和）提供分析凋亡细胞一個靈敏、高效的選擇，幫助有效地協助從實驗中排除DNA斷裂、正在步步走向凋亡或壞死的細胞。