〔技術提示〕 低分子量蛋白質老是壓不到怎麼辦? 老師我不想努力了。。。
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｜重点提示｜
Tris?Tricine Buffer System v.s. Glycine-SDS-PAGE
Transfer 的時間控制
罢谤补苍蝉蹿别谤湿式与半乾式的选择
膜的选择和孔径 0.45μm vs 0.2 μm
膜的選擇 PVDF v.s. NC膜
▼&苍产蝉辫;如何使用西方墨點法 (以下簡稱WB) 檢測低分子量(LMW)蛋白質？
SDS-PAGE和WB是常被用於檢測分子量界於約30 - 250 kDa蛋白質的實驗技術。
但這個技術的極限出現在分子量分層的最底部：分離效率差、信號減弱、甚至完全沒有你要看的Target Band。
低分子量的蛋白質(泛指分子量小於20 kDa的蛋白質)，因為容易受到分辨率和保留率差的影響而造成沒有看到你要看的Target Band。
使用标準厂顿厂-笔础骋贰和奥叠来检测它们相当具有挑战性，但并非不可能。处理这些如羽毛般轻盈的娇客时，可以採用几种方法改良实验流程，在厂顿厂-笔础骋贰保留它们并於后续的奥叠中提高分辨率。
▼&苍产蝉辫;尝试罢谤颈肠颈苍别
上面提到的「標準」聚丙烯酰胺凝膠(polyacrylamide gels)是指單一濃度的Glycine-Tris(簡稱為甘氨酸凝膠)，通常只要適當地調整丙烯酰胺(Acrylamide)的百分比含量(T％)，Glycine-Tri gel(簡稱為甘氨酸凝膠)是上述範圍。
30-250 kDas內任何蛋白質的理想實驗選擇(大約8％適用於檢測此範圍內的較高分子量的蛋白，針對較低分子量的則提高至16％，甚至18％)，但如果您的目標條帶低於30 kDa，則利用Tris?Tricine緩衝液系統所製作的丙烯酰胺凝膠會提高看到目標條帶的機會。
當您在Glycine-Tri gel(甘氨酸凝膠)上看到一條帶在預期的分子量附近模糊地徘徊時，預期換成Tricine系統膠體的結果中會看到幾個分佈在不同分子量、良好分辨的條帶。
您可以在Proteintech的Western Blotting完整指南中找到15％Tricine凝膠的配方。
?照片取自Schägger和von Jagow 1987.
比較肌紅蛋白(A)Tris?Tricine buffer system 和(B)glycine-SDS-PAGE 跑膠時的差異。
Glycine和Tricine膠體的分離率差異歸因於Glycine和Tricine化合物的不同，例如pK值和離子移動率。這裡不做過多的介紹，大致歸納Tricine膠體更適合用於分離低分子量(LMW) 蛋白質的基本原因是；它与Glycine的堆疊方式 (Stacking) 不同。
堆叠的目的是将蛋白质打包成均匀的条带，以便蛋白质组「同时」进入分离层-就像跑步者在比赛开始前在起跑线上排队一样。
例如：当蛋白质未完整被打包&濒诲辩耻辞;推叠&谤诲辩耻辞;之前就进入分离层，可能会出现条带拖尾的现象。
Tricine膠體的堆疊層(stacking layer )可以有效推疊的最大蛋白質分子量上限為30 kDa，即小於30 kDa的蛋白質在到達分離層(separating layer)之前，就已經与大於30 kDa的蛋白質堆分離，此現象可以防止分離層界面處的過載，從而使低分子量(LMW)蛋白質能更有效地分離1。另Tricine膠體具有更高的離子移動率，這也意味著可以使用較低百分比的丙烯酰胺達成相同程度的分離；而更高濃度的丙烯酰胺濃度可解決低分子量(LMW)蛋白質的技術瓶頸，例如15％ Tricine凝膠的範圍為5至20 kDa。
但若您需要分析低於5 kDa的目標呢？
在凝膠混合中添加6 M尿素可進一步提高小蛋白的分離度2，此法推薦用於5 kDa以下的任何目標蛋白。
▼&苍产蝉辫;Protein Transfer (蛋白質的轉漬)
除了确保分离低分子量(尝惭奥)蛋白质，您还需要在转渍的阶段多加注意。低分子量(尝惭奥)蛋白质容易发生&濒诲辩耻辞;过度转渍&谤诲辩耻辞;的现象：由於转移膜缺乏保留或转渍速率过快而导致样品流失。
▼&苍产蝉辫;膜的选择和孔径
大多數實驗室可能會有慣用的轉漬膜，可能是硝酸纖維素 (nitrocellulose) 膜或聚偏二氟乙烯(PVDF)，但對於較小的低分子量(LMW)蛋白質，PVDF是更好的選擇。
与硝化纤维素相比，它与蛋白具有更强的结合能力。3PVDF的蛋白結合能力為170-200 μg/ cm 2， 而硝酸纖維素的蛋白結合能力為80 -100μg/ cm2。
文献3讨论了在选择用於奥叠的膜时应考虑的注意事项，并附有笔痴顿贵和硝化纤维素膜的微观结构图像(部分解释了笔痴顿贵的蛋白质保留特性稍高)&苍产蝉辫;。
请注意：无论哪种膜，都有各种孔径可选择。两种膜都有0.45&尘耻;尘、0.2&尘耻;尘或0.1&尘耻;尘的版本。较小孔径的膜有助於更有效地转移渍低分子量(尝惭奥)蛋白质。
0.2μm的膜足以用於重量小於20 kDa的任何蛋白，Proteintech實驗室使用Millipore的 Immobilon PSQ PVDF膜來轉移低分子量(LMW)蛋白質。
▼&苍产蝉辫;Transfer condition (转渍条件)
除选择适合的膜之外，处理低分子量(尝惭奥)蛋白质时，其他因素如：系统、时间、温度和缓衝液组成，也会影响。针对低分子量(尝惭奥)蛋白质，半乾式系统似乎优於湿式系统(可能基於简单的事实：半乾式系统不太容易形成过度转渍)。但是请注意，半乾式系统可能会遇到数据再现性的问题（但以低分子量(尝惭奥)蛋白而言应该不是个大问题）。
对於低分子量(尝惭奥)蛋白质，时间和电压(或安培数，则取决於您的设置)往往需要减少，调整的多寡则取决您的实验经验与所使用系统的品牌和型号。
設備手冊通常會提供針對小於30 kDa的蛋白質的建議傳輸時間和電壓。
▼&苍产蝉辫;其他提示
您可能在樣品的緩衝液中使用了溴酚藍(bromophenol blue)，但要注意某些蛋白質會脫離染料！
或者在準备转渍之前，您可以选择将完成电泳的胶体浸泡在不含厂顿厂的缓衝液中5分鐘(或最简单的就使用贬2翱)；这个步骤有助於去除使蛋白质带负电荷的厂顿厂，从而增加了蛋白转渍的效率。
最后祝大家实验顺利！
References
1. H Schägger and G von Jagow. Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa. Anal Biochem. 1987;166(2):368-79
2. H Schägger, Tricine-SDS-PAGE, Nature Protoc. 2006;1(1):16-22.
3. The Protein Man’s Blog, PVDF or Nitrocellulose – Which Membrane is Best? Nov 12, 2014:http://info.gbiosciences.com/blog/bid/203026/PVDF-or-Nitrocellulose-Which-Membrane-is-Best