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免疫萤光染色(滨贵)实验—如何减少自体萤光产生？

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免疫萤光染色(滨贵)实验—如何减少自体萤光产生？

 

 

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在上一篇文章 (免疫螢光染色(IF) 實驗—如何直達完美多重染色？) 中介紹了如何藉由Coralite®實現完美多重染色，在這篇文章則是要教大家如何獲得更好的免疫螢光染色 (Immunofluorescence, 以下簡稱IF) 實驗結果！

 

免疫螢光染色(IF) 可利用不同螢光所對應之不同發射光譜 (Emission spectra) 來觀察在同一個載玻片上的多個目標，進而實現多重染色。另外，IF相較於傳統顯色染劑 (Chromogenic stains) ，具有更高的靈敏度及偵測範圍。藉由螢光強度的搭配，可以清楚觀察到低表達及高表達的蛋白質，還具有觀察蛋白質與蛋白質之間共定位(co-localization)的能力。

然而，在某些样品中存在着自体萤光，这会导致我们的目标被遮蔽或高背景的现象产生，并使得分辨出真正的目标染色变得更困难。

 

自体萤光(Autofluorescence)

自体萤光可能由多種因素引起，接下來會分別為大家介紹，並教你如何降低其對實驗的影響。

  1. 交聯固定誘導自体萤光

組織固定常用的方法是使用化學交聯劑，如福馬林、戊二醛等。這些固定劑通過在蛋白質之間產生共價鍵結合，將組織結構固定為型態穩定的不溶性網狀物。在實驗中使用醛固定的缺點是醛會與胺結合形成Schiff bases，這會導致自体萤光的產生 (自体萤光產生之可能性：戊二醛 > 多聚甲醛 > 甲醛，PMID : 6404984)。

這種固定產生的自体萤光具有較廣泛的發射光譜，主要發生在藍、綠、紅光光譜範圍內(PMID : 24722432)。實驗過程中樣品的加熱和脫水也會增加自体萤光的產生，尤其在紅光光譜中的影響更大。

減少自体萤光的最佳方法是在最短的时间内固定样品。另外，关於固定剂的使用，例如：经冷冻 (-20℃) 的乙醇，就是一种很好的细胞固定剂。

 

  

▲圖中為使用綠色(左)和遠紅色(右)濾光片，對未染色且經過福馬林固定的石蠟包埋 (FFPE)腎組織進行內源性自体萤光觀察。可發現在遠紅色濾光片下自体萤光所產生之背景較不明顯。

 

  1. 內源性物質自体萤光

組織中的天然化合物也可能導致自体萤光的產生。

  1. 红血球中的血红素

由於其polyphyrin ring之結構而表現出紅色的自体萤光，這會使分析變得複雜(PMID : 29058770)。

减少这种情况最好的方法是在固定前灌注PBS。然而，對於某些組織樣本，例如：死後(post-mortem) 組織或胚胎組織，PBS 灌注 (perfusion) 並不可行。

另外，在某些情况下，可通过在低 pH 值條件下，用 CuSO4 和 NH4CL 处理或用 H2O2 漂白组织，以減少自体萤光。

 

  1. 胶原蛋白、狈础顿贬

膠原蛋白是一種高度表達、無處不在的結構蛋白，其發射波長位於 300-450 nm 左右的藍色區域 (PMID: 11830520)。

NADH是一種在許多代謝作用中必不可少的酶，且在代謝活躍的細胞和組織 ( 如：肝臟 ) 中的含量會增加。NADH 的發射波長約為 450 nm (PMID : 11830520)。

因此，當用膠原蛋白和 NADH (在藍色/綠色光譜中發射) 這些高濃度化合物染色組織時，若選擇在红色和远红色区域发射光谱的萤光团，例如：和，將有助於區分特定染色和自体萤光。

 

  1. 脂褐素 (Lipofuscin)

是一种颗粒状的亲脂性色素，随着年龄的增长，它会积聚在许多组织的溶酶体中，包括骨骼肌、神经元和心臟。

脂褐素在整个光谱中都可发出萤光，但在 500-695 nm 處發光最強烈，并且因為其颗粒状外观可能被误认為是特定染色。為了抵??消这些影响，亲脂性染料苏丹黑 B (Sudan black B) 可以有效結合脂褐素顆粒以消除自体萤光 (PMID: 10330448)。然而，苏丹黑 B 會在遠紅光光譜中發出螢光，因此在規劃多重染色時必須考慮到這一點。

 

自体萤光解決方法統整

  1. 使用交联固定剂的替代品或尝试利用多聚甲醛以固定组织，并始终在最短时间内完成固定。
  2. 可使用硼氢化钠以減少福馬林誘導的自体萤光，但硼氫化物在中性辫贬环境下不稳定，实验重复性较低。
  3. 在固定前利用 PBS 灌注组织以去除红血球。
  4. 苏丹黑 B (Sudan black B) 和鉻黑 T (Eriochrome black T ) 等化合物可減少脂褐素和福馬林所誘導的自体萤光。
  5. 根據樣品中可能存在的自体萤光發射波長來挑選合適的螢光團。通常，等远红色萤光团最适合。
  6. 目前市場上存在一些市售試劑，如：TrueVIEW (VectorLabs)，已被證明可以減少多種因素所造成的自体萤光。
  7. 无论选择什麼方法，始终要进行内源性组织对照 (無一抗或二抗) 和一抗對照 (僅二抗)，以揭示免疫螢光染色實驗中的自体萤光水平和非特異性結合。

 

参考文献：

  1. Willingham MC. An alternative fixation-processing method for preembedding ultrastructural immunocytochemistry of cytoplasmic antigens: the GBS (glutaraldehyde-borohydride-saponin) procedure. J Histochem Cytochem. 1983;31(6):791-798. doi:10.1177/31.6.6404984
  2. Davis AS, Richter A, Becker S, et al. Characterizing and Diminishing Autofluorescence in Formalin-fixed Paraffin-embedded Human Respiratory Tissue. J Histochem Cytochem. 2014;62(6):405-423. doi:10.1369/0022155414531549
  3. Whittington NC, Wray S. Suppression of Red Blood Cell Autofluorescence for Immunocytochemistry on Fixed Embryonic Mouse Tissue. Curr Protoc Neurosci. 2017;81:2.28.1-2.28.12. Published 2017 Oct 23. doi:10.1002/cpns.35
  4. Georgakoudi I, Jacobson BC, Müller MG, et al. NAD(P)H and collagen as in vivo quantitative fluorescent biomarkers of epithelial precancerous changes. Cancer Res. 2002;62(3):682-687.
  5. Schnell SA, Staines WA, Wessendorf MW. Reduction of lipofuscin-like autofluorescence in fluorescently labeled tissue. J Histochem Cytochem. 1999;47(6):719-730. doi:10.1177/002215549904700601

 

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